Phân tích RNA trong pháp y: Bước chuyển từ cá thể hóa sang bối cảnh hóa dấu vết

Sinh học phân tử pháp y từ lâu đã đóng góp lớn vào việc giải quyết những tội ác nghiêm trọng như giết người, xâm phạm tình dục, … và từ đó trở thành một bộ phận không thể thiếu của y học pháp y và khoa học pháp y ứng dụng.

Kể từ khi phân tích ADN pháp y phát triển với việc phát hiện các đoạn lặp lại ngắn liên tiếp vào đầu những năm 1990, những xét nghiệm sinh học phân tử mang tính khách quan cao này đã trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất trong nhiều cuộc điều tra hình sự. STR (còn được gọi là microsatellite) là các trình tự ADN ngắn, thường không mã hóa, có độ dài từ hai đến sáu cặp base, xuất hiện lặp lại nhiều lần trong bộ gen của sinh vật và cho phép tạo ra các hồ sơ ADN cá thể hóa có thể được sử dụng trước tòa ngay cả từ những dấu vết tối thiểu.

Việc khớp các bằng chứng dấu vết sinh học một cách đáng tin cậy như vết máu, dấu vết nghi ngờ là dịch cơ thể, tóc hoặc tế bào biểu mô da với một cá thể cụ thể còn được gọi là cá thể hóa. Các phương pháp cá thể hóa không ngừng được cải thiện, ngày càng nhạy hơn và bền vững hơn. Từ lâu, người ta đã có thể tạo ra hồ sơ ADN ngay cả từ một tế bào đơn lẻ và phân tích thành công những vật liệu bị phân hủy nghiêm trọng và cũ kỹ, ví dụ như xương ngâm trong nước hàng thập kỷ hoặc mô bị phân hủy nặng. Các phương pháp thống kê sinh học hiện đại dựa trên các thuật toán và mô phỏng phức tạp có thể xử lý nhiều dữ liệu hơn đáng kể so với các phương pháp có sẵn, ngày nay cũng cho phép tính toán ngay cả với các hồ sơ hỗn hợp ADN phức tạp và không hoàn chỉnh được chiết xuất từ một lượng nhỏ vật liệu bị phân hủy để đánh giá khả năng đóng góp chung của những người để lại dấu vết vào tội phạm.

Sự thay đổi góc nhìn trong sinh học phân tử pháp y

Tuy nhiên, trong những năm gần đây, một sự thay đổi góc nhìn đã diễn ra trong sinh học phân tử pháp y và trong cách diễn giải các phát hiện của nó trước tòa: sự chuyển dịch của mối quan tâm từ cá thể hóa sang bối cảnh hóa các dấu vết.

Bối cảnh hóa được hiểu là việc gán các bằng chứng dấu vết theo bối cảnh nguồn gốc của chúng. Để đạt được mục đích này, sinh học phân tử pháp y hiện đại ngày nay sử dụng một số phương pháp điều tra bối cảnh hóa khác nhau, bao gồm xác định kiểu hình ADN pháp y (tức là suy luận các đặc điểm hình thái bên ngoài có thể quan sát được của một cá thể từ ADN), đạn phân tử (phân tích sinh học phân tử các dấu vết sinh học và mô hình dấu vết được tạo ra bởi các phát súng nhắm vào con người) và phân tích RNA pháp y.

Phân tích RNA pháp y: Lịch sử và tiềm năng

Tài liệu pháp y đầu tiên đề cập đến RNA được chiết xuất từ mô sau khi chết được tìm thấy trong một bài báo tiếng Đức của Oehmichen và cộng sự năm 1984 về quá trình sinh tổng hợp ADN và RNA sau khi chết. Kể từ đó, mối quan tâm đến phân tích mRNA cũng như các ứng dụng pháp y của nó đã tăng lên đáng kể, đặc biệt là trong việc xử lý các vấn đề bối cảnh hóa khác nhau. Các bài tổng quan gần đây về tiềm năng ứng dụng phân tích RNA pháp y đã được công bố.

RNA cũng được chứng minh là bền hơn đáng kể và ít bị phân hủy trong các mô sau khi chết cũng như trong các vết bẩn sinh học thậm chí đã hàng chục năm tuổi so với giả định trước đây. Các phương thức chiết xuất RNA mới liên tục được phát triển. Tuy nhiên, sự phân hủy sau khi chết và tính nhạy cảm của mRNA nói riêng với các RNase phổ biến vẫn là vấn đề cơ bản đối với việc đánh giá nó, đòi hỏi các biện pháp phòng ngừa đặc biệt khi thu thập, bảo quản và xử lý các dấu vết.

Phân tích RNA pháp y để xác định loại vật liệu dấu vết

Phần lớn các vết bẩn sinh học được sử dụng trong giám định pháp y bắt nguồn từ các tiếp xúc da và dịch cơ thể người. Các dịch cơ thể phổ biến nhất được xác định bao gồm máu, nước bọt, tinh dịch, dịch tiết âm đạo và máu kinh nguyệt. Các kết quả nghiên cứu đầu tiên về việc xác định dịch cơ thể bằng cách sử dụng biểu hiện RNA đã được trình bày vào đầu những năm 2000. Kể từ đó, nhiều nghiên cứu liên quan khác đã được công bố báo cáo về việc phát hiện và xác định dấu vết sinh học dựa trên RNA. Điều này cho phép phát hiện hoặc xác định một hoặc nhiều dấu vết sinh học nêu trên cũng như các dấu vết khác, ví dụ như dịch tiết mũi, mồ hôi hoặc các cơ quan khác nhau.

Nguyên tắc của việc xác định loại dấu vết dựa trên RNA bao gồm việc phát hiện các RNA đặc trưng cho dấu vết, tức là các RNA được phiên mã độc quyền hoặc ít nhất là rất phổ biến trong các tế bào của một loại dấu vết nhất định và do đó xác định về mặt định lượng sự hiện diện của loại bằng chứng dấu vết này. Ưu điểm của kỹ thuật này so với các phương pháp truyền thống (thường là hóa miễn dịch) là độ đặc hiệu cao hơn đáng kể, độ nhạy cao hơn và cơ hội điều tra thành công ngay cả các hỗn hợp phức tạp của các yếu tố dấu vết. Ngoài ra, kỹ thuật dựa trên RNA cho phép xác định chính xác các chất tiết của cơ thể, chẳng hạn như dịch tiết âm đạo hoặc trực tràng, mà trước đây chưa có xét nghiệm nào.

Việc sử dụng kỹ thuật chiết xuất kết hợp cũng cho phép chiết xuất gADN đồng thời với RNA. Điều này mở ra khả năng không chỉ xác định loại vật liệu dấu vết từ bằng chứng hiện trường nhỏ nhất mà còn tạo ra hồ sơ ADN của người đã để lại dấu vết, do đó cá thể hóa bằng chứng mà không cần tiêu hao thêm các mẫu hiện trường không thể thay thế.

Tuy nhiên, không phải tất cả các marker RNA được phát hiện cho đến nay đều hoàn toàn đặc hiệu, ví dụ như các marker thường được sử dụng để phát hiện dịch tiết âm đạo cũng được tìm thấy trong niêm mạc trực tràng, do đó cần sử dụng thêm các marker đặc hiệu cho niêm mạc trực tràng để có thể phân biệt các dấu vết này. Sự đồng biểu hiện không đặc hiệu trong các dịch cơ thể khác cũng đã được quan sát thấy trong một số trường hợp cá biệt đối với các marker khác. Tuy nhiên, độ đặc hiệu lên đến 100% có thể đạt được bằng cách kết hợp nhiều marker cho mỗi dịch cơ thể và áp dụng các hướng dẫn diễn giải phù hợp.

Giới hạn phát hiện, tức là lượng RNA hoặc dấu vết sinh học tối thiểu phải có để xác định thành công dịch cơ thể phụ thuộc vào một số yếu tố. Chúng bao gồm loại dịch cơ thể, các marker được phân tích, xét nghiệm được sử dụng và sự khác biệt về biểu hiện giữa các cá thể. Do tính nhạy cảm của các phân tử RNA sợi đơn với sự phân hủy enzyme bởi các RNase có trong môi trường, khả năng phát hiện RNA có thể bị giảm so với ADN trong vật liệu dấu vết bị hư hỏng, cũ kỹ hoặc được bảo quản không đúng cách. Với điều kiện bảo quản thuận lợi, vẫn có thể thực hiện thành công việc xác định dịch cơ thể dựa trên mRNA sau nhiều năm hoặc thậm chí nhiều thập kỷ. Mặt khác, khả năng tồn tại của các marker mRNA đặc hiệu cho dịch cơ thể có thể giảm xuống còn vài tuần hoặc vài ngày trong điều kiện không thuận lợi. Do những hạn chế này trong phân tích biểu hiện mRNA, các smallRNA ngắn hơn và bền hơn đáng kể với chiều dài từ 22 đến 31 nucleotide có thể được coi là các lựa chọn thay thế phù hợp cho sinh học phân tử pháp y và được phân tích bổ sung. Tuy nhiên, do các smallRNA ít được đặc trưng hơn so với mRNA, đôi khi có độ đặc hiệu mô thấp hơn và cũng đặt ra thách thức phân tích lớn hơn do tính ngắn của phân tử của chúng, phần lớn các kỹ thuật hiện được sử dụng để xác định dịch cơ thể dựa trên RNA dựa trên việc nhận biết mRNA được phiên mã khác biệt. Các công trình ban đầu về sự kết hợp cả hai loại RNA trong một xét nghiệm đã được thực hiện.

Phương pháp phát hiện trong phân tích RNA pháp y

Việc phát hiện các marker RNA được biểu hiện đặc hiệu trong một loại tế bào nhất định thường được thực hiện bằng cách sử dụng phản ứng chuỗi polymerase end-point với phiên mã ngược. RNA được chuyển đổi thành cADN và khuếch đại, sau đó các đoạn được làm giàu được phân tách theo chiều dài bằng cách sử dụng điện di mao quản và phát hiện bằng huỳnh quang cảm ứng laser. Việc sử dụng các xét nghiệm multiplex PCR cho phép kiểm tra đồng thời khoảng 20 đến 30 bản phiên mã trong một lần phân tích. Tuy nhiên, quy trình này chỉ có thể phân biệt giữa sự hiện diện hoặc vắng mặt của các bản phiên mã, không thể ghi nhận định lượng số lượng bản phiên mã.

Việc phát hiện cũng như định lượng chính xác hơn nhiều các bản phiên mã cụ thể cũng có thể đạt được bằng cách sử dụng PCR định lượng. Tuy nhiên, khả năng multiplex thấp và tăng lượng mẫu đầu vào hạn chế khả năng ứng dụng của nó trong lĩnh vực pháp y. Kể từ năm 2015, các kỹ thuật cải tiến cho giải trình tự song song hóa khối lượng lớn các mẫu axit nucleic với thông lượng cao cũng đã được sử dụng trong phân tích RNA pháp y.

Sau khi được giới thiệu vào giữa những năm 2000, kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới nhanh chóng tìm đường vào lĩnh vực pháp y. Ngoài khả năng multiplex cao hơn, cho phép phân tích đồng thời nhiều marker hơn đáng kể từ cùng một đầu vào, một ưu điểm khác của kỹ thuật này là nó không chỉ xác định chiều dài của các đoạn tương ứng mà còn có thể đọc trình tự axit nucleic của chúng. Vì các phân tử RNA đại diện cho các bản phiên mã của ADN, trình tự base của chúng tương ứng với trình tự của khuôn ADN.

Trong tương lai, khả năng multiplex của công nghệ giải trình tự thế hệ mới cũng sẽ giúp kết hợp các marker RNA cho một số khía cạnh bối cảnh hóa khác nhau trong một xét nghiệm. Ví dụ, có thể xác định trong một xét nghiệm duy nhất tuổi của dấu vết ngoài việc xác định loại dấu vết. Do đó, việc sử dụng giải trình tự thế hệ mới trong phân tích RNA pháp y có thể góp phần làm cho lượng thông tin bối cảnh đáng kể chứa trong hệ phiên mã có thể tiếp cận được cho các mục đích pháp y.

Tiềm năng phát triển và các dự án nghiên cứu cho phân tích RNA pháp y

Ngoài sự khác biệt về thành phần hệ phiên mã, biểu hiện gen trong quần thể tế bào của dịch cơ thể và mô cơ quan người cũng được điều chỉnh bởi các yếu tố bên trong và bên ngoài khác.

Nghiên cứu sự thay đổi biểu hiện gen do các quá trình nội tại

Nhiều quá trình nội tại có liên quan đến việc điều chỉnh biểu hiện gen. Các dự án pháp y đang nghiên cứu, ví dụ như về sự phát triển các phương pháp xác định thời gian để lại dấu vết sinh học từ biểu hiện gen, có thể thay đổi theo thời gian trong ngày.

Ngoài ra, chẩn đoán một số rối loạn lâm sàng, phân biệt với các nguyên nhân tử vong không tự nhiên, đóng vai trò quyết định trong y học pháp y truyền thống. Những khó khăn đặc biệt được đặt ra bởi các trường hợp tử vong đột ngột không giải thích được, xảy ra mà không có triệu chứng báo trước, không có tương quan hình thái học và thường do các tình trạng tim chưa được biết đến trước đó. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số rối loạn tim nhất định có liên quan đến sự biểu hiện thay đổi của các mRNA khác nhau hoặc các loại RNA khác.

Trong tương lai, việc phát hiện sự biểu hiện gen thay đổi như vậy do đó có thể hỗ trợ xác định nguyên nhân tử vong trong pháp y, còn được gọi là khám nghiệm tử thi phân tử.

Nghiên cứu sự thay đổi biểu hiện gen do các quá trình ngoại sinh

Các yếu tố ngoại sinh cũng có thể mang lại sự thay đổi trong biểu hiện gen như một phản ứng ít nhiều có hệ thống. Sau một chấn thương, ví dụ như vết thương do dao, quá trình lành vết thương bắt đầu ngay lập tức trong mô còn sống. Quá trình lành vết thương diễn ra theo các giai đoạn quy trình theo trình tự thời gian. Trong các giai đoạn quá trình này, đầu tiên là tiểu cầu, sau đó là các loại tế bào miễn dịch khác nhau và sau đó là tế bào sừng, nguyên bào sợi và tế bào nội mô được kích hoạt lần lượt để thúc đẩy quá trình lành vết thương. Do đó, mỗi giai đoạn lành vết thương có một dấu hiệu sinh hóa cụ thể với trạng thái phiên mã của nó. Trong khi các kiểm tra mô học và hóa mô miễn dịch vẫn được sử dụng rộng rãi để suy luận tuổi của vết thương từ các lát cắt mô nhuộm màu, các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng việc kiểm tra hệ phiên mã đơn thuần hoặc kết hợp với kiểm tra hệ protein có thể cung cấp thông tin về tuổi của vết thương.

Hơn nữa, việc hấp thụ một số chất nhất định có thể kích hoạt điều chỉnh biểu hiện gen phản ứng trong các mô khác nhau. Các nghiên cứu ban đầu về khả năng phát hiện việc hấp thụ các chất độc học liên quan từ những thay đổi trong biểu hiện gen đã có sẵn.

Phân tích tính toàn vẹn của bản phiên mã và sự phân hủy RNA khác biệt

Ngoài những thay đổi của biểu hiện gen thì tính toàn vẹn của các bản phiên mã RNA có thể cung cấp thông tin về các vấn đề liên quan đến pháp y. Ví dụ, kiểm tra thành phần hệ phiên mã của các dấu vết sinh học đã được bảo quản trong các điều kiện khác nhau trong các khoảng thời gian khác nhau cho thấy các phân tử RNA bị phân hủy trong các dịch cơ thể này theo thời gian. Tốc độ phân hủy khác biệt so với tuổi của dấu vết sinh học. Sự phân hủy axit nucleic trong tế bào và mô, bắt đầu sau khi cơ thể con người chết, cũng tạo thành cơ sở cho việc sử dụng tính toàn vẹn của bản phiên mã để ước tính khoảng thời gian sau khi chết.

Kết luận

Từ xác định loại dấu vết, ước tính thời gian để lại, hỗ trợ xác định nguyên nhân tử vong, xác định tuổi vết thương cho đến phát hiện sự hấp thụ chất độc, phân tích RNA pháp y đang mở ra những chân trời mới, bổ sung một cách mạnh mẽ cho các phương pháp truyền thống vốn chỉ tập trung vào ADN. Sự chuyển dịch từ cá thể hóa sang bối cảnh hóa không chỉ làm phong phú thêm bức tranh về dấu vết tội phạm mà còn cung cấp cho cơ quan điều tra và tòa án những công cụ ngày càng tinh vi để tái tạo lại sự thật khách quan từ những mảnh vụn bằng chứng nhỏ bé nhất.

Bài viết được tham khảo từ bài báo RNA Analysis in Forensic Molecular Biology 

Để tìm hiểu chi tiết thêm về ứng dụng và tính năng của các sản phẩm phục vụ cho lĩnh vực pháp y, xác định danh tính, huyết thống, vui lòng liên hệ chúng tôi để được hỗ trợ tư vấn trực tiếp.