Nguồn Gốc Và Ảnh Hưởng Của Mycoplasma Trong Nuôi Cấy Tế Bào

Đặc điểm của Mycoplasma

Mycoplasma là một nhóm vi sinh vật có đặc điểm chính là không có thành tế bào – một cấu trúc vốn có ở tất cả các loại vi khuẩn khác. Do điểm khác biệt cơ bản này, giới khoa học đã xếp chúng vào một lớp riêng trong sinh vật nhân sơ với tên gọi là Mollicutes.

Ngoài đặc điểm không có thành tế bào, mycoplasma được coi là những sinh vật có khả năng tự nhân đôi nhỏ nhất hiện nay. Điều này không chỉ đề cập đến kích thước của chúng mà còn cả kích thước bộ gen, tổ chức tế bào cũng như khả năng sinh lý trong việc tổng hợp và chuyển hóa một số hợp chất. Mycoplasma chỉ chứa các thành phần tế bào tối quan trọng bao gồm màng tế bào, ribosome và nhiễm sắc thể vi khuẩn.

Với kích thước rất nhỏ, đường kính chỉ từ 0,3 đến 0,8 micromet, cùng màng tế bào linh hoạt, mycoplasma có thể đi xuyên qua các bộ lọc sinh học kháng khuẩn thông thường có kích thước lỗ 0,45 micromet. Chính đặc điểm này cùng với lối sống cộng sinh với các sinh vật khác, khả năng kháng lại các loại kháng sinh thời bấy giờ và khó khăn trong việc nuôi cấy chúng mà không có tế bào chủ đã khiến giới khoa học ban đầu lầm tưởng mycoplasma là virus. Trên thực tế, tác nhân gây bệnh mycoplasma đầu tiên được xác định ở người (Mycoplasma pneumoniae) ban đầu cũng bị cho là một loại virus.

Do kích thước siêu nhỏ và không có thành tế bào, mycoplasma có hình dạng đa dạng, biến đổi từ dạng hình cầu hoặc hình quả lê cho đến dạng sợi phân nhánh hay xoắn ốc. Vì quá trình nhân đôi bộ gen không đồng bộ với quá trình phân chia tế bào, người ta thường quan sát thấy các dạng sợi dài và chuỗi tế bào hình hạt.

Kích thước bộ gen của chúng dao động trong khoảng từ 580 đến 1300 kilobase (đối với chi Mycoplasma) và lên tới 2200 kilobase đối với các loài Spiroplasma. Con số này tương phản rõ rệt với các vi khuẩn khác thường có bộ gen lớn hơn 3000 kilobase (ví dụ, Escherichia coli có 5500 kilobase). Hệ quả là mycoplasma chỉ sở hữu khoảng một phần năm số lượng gen so với các vi khuẩn khác (khoảng 500 đến 1000 gen, so với 5400 gen ở E. coli). Điều này khiến mycoplasma được xem như hình mẫu gần nhất của khái niệm “tế bào tối thiểu”. Cấu trúc di truyền tối giản này phù hợp với lối sống cộng sinh và ký sinh của chúng cho phép chúng giảm thiểu các con đường trao đổi chất cần thiết.

Tỷ lệ nhiễm Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào nguyên phát và các dòng tế bào liên tục có nguồn gốc từ người hoặc động vật phải đối mặt với một số thách thức ảnh hưởng đến các ứng dụng sinh học và công nghệ sinh học. Trong số đó có nhiễm trùng với vi sinh vật và ở đây đặc biệt là với mycoplasma có thể cản trở đáng kể việc sử dụng các tế bào này. Mycoplasma lần đầu tiên được phân lập vào năm 1956 từ một dòng nuôi cấy tế bào bị nhiễm bẩn. Trớ trêu thay, trong các nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiễm mycoplasma lên nuôi cấy tế bào, người ta phát hiện ra rằng dòng nuôi cấy tế bào đối chứng âm tính chưa được nuôi cấy đã bị nhiễm bẩn. Ngay sau đó, người ta xác nhận rằng các dòng tế bào liên tục, ổn định thường xuyên bị nhiễm bẩn. Chỉ một tế bào mycoplasma có thể phát triển lên đến 10⁶ CFU/mL trong vòng 3-5 ngày trong một dòng nuôi cấy tế bào bị nhiễm. Thường có từ 100 đến 1000 mycoplasma bám vào mỗi tế bào bị nhiễm. Nhiễm bẩn ban đầu có thể không bị phát hiện vì nhiễm mycoplasma không tạo ra sự phát triển đục rõ ràng như thường thấy với nhiễm bẩn vi khuẩn hoặc nấm khác. Thông thường mycoplasma có thể đạt mật độ rất cao trong nuôi cấy tế bào mà không gây ra sự thay đổi độ pH (và do đó không có sự thay đổi màu sắc của hầu hết môi trường nuôi cấy). Một số mycoplasma tạo ra rất ít biểu hiện bệnh lý tế bào rõ ràng và sự nhiễm bẩn rõ ràng có thể không bị phát hiện trong nhiều tháng. Hầu như tất cả các báo cáo và nghiên cứu về nhiễm mycoplasma trong nuôi cấy tế bào đều liên quan đến tế bào người và động vật.

Nói chung, các dòng nuôi cấy tế bào nguyên phát và các dòng nuôi cấy ở các lần cấy chuyển sớm ít bị nhiễm bẩn hơn các dòng tế bào liên tục: các dòng nuôi cấy nguyên phát và các dòng nuôi cấy ở lần cấy chuyển sớm lần lượt vào khoảng 1% và 5% và các dòng tế bào liên tục trong khoảng 15-35%

Việc ứng dụng ngày càng mở rộng của các dòng tế bào trong nghiên cứu và công nghệ sinh học và việc sử dụng ngày càng nhiều một số loại kháng sinh nhất định trong nuôi cấy thường quy có lẽ đã dẫn đến sự gia tăng nhiễm mycoplasma trong các dòng nuôi cấy tế bào, hiện đã đạt đến tỷ lệ dịch. Có vẻ như tỷ lệ nhiễm bẩn cao hơn đối với các dòng nuôi cấy được duy trì liên tục với những “kháng sinh nuôi cấy tế bào” như vậy.

Nguồn gốc nhiễm Mycoplasma

Các nghiên cứu về môi trường sống tự nhiên của mycoplasma liên quan đến kỹ thuật viên người, huyết thanh bò và các dòng nuôi cấy nguyên phát. Các mẫu mô được sử dụng để bắt đầu nuôi cấy tế bào không phải là nguồn chính gây nhiễm mycoplasma. Hơn nữa, các loài mycoplasma có nguồn gốc từ chuột, gia cầm và chó chỉ chiếm 0,5 đến 1% trong số các mycoplasma được phân lập từ các dòng nuôi cấy bị nhiễm bất chấp việc sử dụng rộng rãi các dòng tế bào chuột.

Tỷ lệ cao của các loài mycoplasma có nguồn gốc từ bò, chủ yếu là A. laidlawii và M. arginini, liên quan đến huyết thanh bò thai nhi hoặc sơ sinh. Để ngăn ngừa nhiễm bẩn và loại bỏ các tác nhân ngẫu nhiên thường được phát hiện nhất trong huyết thanh bò, cụ thể là mycoplasma và virus gây tiêu chảy ở bò (BVDV), các nhà cung cấp hiện áp dụng các quy trình kiểm tra vô trùng tinh vi hơn, sử dụng chiếu xạ gamma và lọc, và đã thực hiện các quy tắc và kiểm soát chặt chẽ hơn tại các lò mổ.

Vì tỷ lệ phần trăm lớn nhất của mycoplasma được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào có nguồn gốc từ người, nên có thể logic khi cho rằng nhân viên phòng thí nghiệm là một trong những nguồn gây nhiễm bẩn chính. Nếu nuôi cấy tế bào người, huyết thanh bò hoặc nuôi cấy nguyên phát là nguồn nhiễm trùng duy nhất, thì sẽ có những nhiễm bẩn mycoplasma ngẫu nhiên trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy và chỉ một số dòng nuôi cấy trong một đơn vị phòng thí nghiệm là dương tính với mycoplasma. Tuy nhiên, đây không phải là kiểu nhiễm bẩn đã được quan sát. Rõ ràng, trong các phòng thí nghiệm có tế bào bị nhiễm bẩn, hầu hết hoặc tất cả các dòng nuôi cấy đều dương tính chứa cùng loài mycoplasma. Vì vậy, các dòng tế bào bị nhiễm mycoplasma chính là nguồn quan trọng nhất để lây lan thêm sự nhiễm bẩn. Điều này là do sự dễ dàng tạo ra giọt bắn trong quá trình xử lý nuôi cấy tế bào, nồng độ cao của mycoplasma trong các dòng nuôi cấy bị nhiễm (10^6 đến 10^8 CFU/ml dịch nổi) và khả năng tồn tại kéo dài của mycoplasma khô.

Ảnh hưởng của nhiễm Mycoplasma

Nhiều loài mycoplasma tạo ra các hiệu ứng gây bệnh tế bào nghiêm trọng ở một số dòng tế bào trong khi những loài khác có thể gây ra rất ít biểu hiện bệnh lý tế bào rõ ràng. Có thể có sự khác biệt định tính và định lượng trong cùng một thông số tùy thuộc vào loài mycoplasma gây nhiễm, điều kiện nuôi cấy, loại dòng nuôi cấy tế bào bị nhiễm, cường độ và thời gian nhiễm trùng, một nhiễm trùng bổ sung với virus và các thông số khác. Vì vậy, nhiễm bẩn có thể can thiệp vào hầu như mọi thông số được đo trong nuôi cấy tế bào trong quá trình nuôi cấy thường quy hoặc trong các nghiên cứu thực nghiệm. Do đó, mycoplasma trong các dòng nuôi cấy này không thể đơn giản bị bỏ qua hoặc coi là những sinh vật vô hại bên cạnh. Bên cạnh việc mất đi một dòng nuôi cấy quan trọng, trong trường hợp xấu nhất tất cả các thí nghiệm có thể bị ảnh hưởng bởi các nhiễm trùng và tạo ra các kết quả giả.

Mycoplasma có một phổ tác động gây bệnh tế bào khổng lồ trên tế bào, từ không có thay đổi đáng chú ý về hình thái đến những thay đổi tối thiểu được đặc trưng bởi sự gia tăng độ hạt của tế bào chất đến một hiệu ứng gây bệnh tế bào rõ ràng với sự phân giải tế bào thỉnh thoảng. Một thay đổi đặc trưng về hình thái nhân thường liên quan đến nhiễm bẩn mycoplasma là sự xuất hiện của nhiễm sắc thể ngưng tụ, sự tập trung hạch nhân và các dấu hiệu khác của quá trình chết tế bào theo chương trình sắp xảy ra. Những hiệu ứng hình thái này có thể được đảo ngược bằng cách thay đổi môi trường hoặc bằng cách bổ sung chất dinh dưỡng mới. Giống như hình thái, các ảnh hưởng của nhiễm bẩn mycoplasma lên sự phát triển của tế bào cực kỳ thay đổi, từ không có đến ngừng hoàn toàn sự tăng sinh tùy thuộc vào loại tế bào, loài mycoplasma và nồng độ mycoplasma. Ngay cả sự tăng cường tăng trưởng tế bào cũng đã được báo cáo. Các dòng nuôi cấy bị nhiễm nặng được đặc trưng bởi sự phát triển còi cọc, bất thường và các tế bào tròn, thoái hóa với sự xuất hiện “bị ăn mòn” bằng mắt thường ở rìa của các lớp đơn bào. Sự tách rời của các lớp đơn bào do nhiễm mycoplasma cũng đã được quan sát thấy.

Một trong những lý do rõ ràng nhất cho những ảnh hưởng này là mycoplasma tiêu thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy làm cạn kiệt glucose, arginine, tiền chất axit nucleic, axit amin, vitamin, vân vân, do đó là đối thủ cạnh tranh trực tiếp của các tế bào nhân thực được nuôi cấy. Thường nồng độ mycoplasma trong môi trường hoặc trên tế bào vượt quá số lượng tế bào nhân thực hơn một nghìn lần. Sự cạn kiệt chất dinh dưỡng trong môi trường dẫn đến những ảnh hưởng sâu sắc đến chuyển hóa và chức năng tế bào. Mycoplasma thường chuyển hóa các yếu tố dinh dưỡng nhanh hơn đáng kể so với vật chủ của chúng. Chúng còn cảm ứng các tế bào chủ sản xuất nucleotide, như đã được chứng minh cho các trường hợp nhiễm M. orale trong đó deoxyadenosine được tăng lên rất cao và chuyển đổi thành ribonucleotide và các nucleotide này được tích hợp vào RNA của mycoplasma.

Bài viết được tham khảo từ bài báo Mycoplasma Contamination Of Cell Cultures

Để tìm hiểu chi tiết thêm về ứng dụng và tính năng của các sản phẩm phục vụ cho quá trình xác định Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào, vui lòng liên hệ chúng tôi để được hỗ trợ tư vấn trực tiếp.